METTL3介导HDGF mRNA的m6A修饰促进胃癌进展影响预后

2019-11-28 常笑医学网

胃癌是世界上发病率第五、死亡率第三的恶性肿瘤,且几乎一半患者集中在东亚地区。大多数胃癌患者在确诊时都已处于晚期,伴有广泛转移。晚期患者的预后通常较差。因此,寻找新的生物标志物和靶点成为了当务之急。

有观点认为,进行能量代谢的重编程是肿瘤的一大特征。肿瘤细胞调整代谢过程,以助于自身的恶性增殖。在肿瘤细胞中,糖酵解的表现为糖消耗量上升和有氧条件下优先产生乳酸,这能够为肿瘤持续增殖和转移提供物质和能量支持。因此,靶向葡萄糖转运体和糖酵解途径酶可能为肿瘤的治疗提供新的方法。目前已有一些糖酵解酶抑制剂进入临床前研究阶段。新发现的证据也显示,在多种肿瘤中,一些驱动基因和抑制基因通过调节糖酵解过程调控肿瘤发生和增殖。另外,糖酵解在肿瘤微环境的调节中起到关键作用,它能够影响炎性因子分泌、免疫逃逸和肿瘤血管生成。血管生成是胃癌细胞增殖和转移的重要环节。因此,若要开发胃癌诊疗新方法,就要了解糖酵解和血管生成的分子机制。

还有研究发现,RNA的m6A修饰以及参与这一过程的甲基转移酶METTL3与肿瘤发展相关。在真核细胞的mRNA中,m6A修饰是最常见的修饰方式,它能够调节mRNA的稳定性、剪切、运输、定位以及RNA-蛋白质相互作用。一些特异性蛋白质可与mRNA m6A修饰位点结合,直接或间接影响RNA功能。然而,m6A修饰的生物学意义及其在胃癌中的调节机制仍未明确。

不久前,南京鼓楼医院的学者Qiang Wang等人在Gut上发表文章,结合上述观点,阐述了胃癌中甲基化酶METTL3通过对HDGF mRNA进行m6A修饰调节糖酵解过程,调控肿瘤发生发展;并提出METTL3可能成为胃癌诊疗的新分子标志物和药物靶点。研究发现如下:

胃癌患者中升高的METTL3表达水平与较差的预后相关。

研究者们测定了28个胃癌组织和相应正常胃粘膜样本中的m6A RNA水平,发现胃癌组织中m6A RNA水平显著升高。比色ELISA法证实了该结果。假设胃癌中m6A RNA水平的升高是m6A writer和eraser失调所致,因此,研究者们又测定了28个胃癌组织和相应癌旁组织中主要m6A writer(METTL3、METTL14和WTAP)和eraser(ALKBH5和FTO)的mRNA水平。结果显示,胃癌组织中,甲基转移酶METTL3的表达显著升高,而其他基因的表达无明显变化。m6A RNA水平也与METTL3的表达显著相关。TCGA数据库和在线生物信息学工具Kaplan-Meier Plotter也显示,胃癌组织中METTL3的mRNA水平显著上升且此类患者OS更短。

与上述结果一致的是,14个人胃癌组织中,有12个组织(86%)的METTL3蛋白质水平显著升高。另外,胃癌细胞中的METTL3蛋白质水平也显著上升。免疫组化染色结果证实了这一点。临床上,METTL3水平与一些病理学特征显著相关,例如淋巴结转移(p=0.046)和TNM分期(p=0.005)。然而,弥漫型胃癌和肠型胃癌患者中METTL3的表达无显著差异。数据显示,METTL3表达上调的患者五年OS更低。同时,单变量Cox回归分析显示,淋巴结状态、TNM分期和METTL3表达均与五年生存率具有显著相关性;多元Cox回归分析显示,METTL3是胃癌患者预后的独立影响因素。此外,为了更深入地了解METTL3的表达,研究者们进行了一项时间相关的ROC曲线分析,发现TNM分期和METTL3风险评分联合使用比这两种评分单独使用更加有效。上述结果显示,胃癌患者中m6A修饰增加,METTL3水平升高,METTL3可能是影响患者预后的独立因素。

图1 METTL3表达上调与胃癌患者较差的预后相关。(A)抗m6A抗体结合胃癌组织及相应正常胃粘膜mRNA的dot blot分析。(B)比色ELISA法测定胃癌及正常胃粘膜组织的mRNA水平。(C)qRT-PCR测定胃癌及正常胃粘膜组织的mRNA水平。(D)TCGA数据库中胃癌(n=413)及正常胃粘膜组织(n=28)的mRNA水平。(E)在线工具显示的METTL3表达量不同的患者OS的Kaplan-Meier曲线。(F)Western blotting测定胃癌及正常胃粘膜组织的蛋白质水平。(G)免疫组化实验。(H)METTL3免疫反应评分变化的分布(n=83)。(I)METTL3表达量不同的患者OS的Kaplan-Meier曲线(n=83)。(J)胃癌患者的多元Cox回归分析。(K)时间相关ROC曲线分析。

胃癌中P300介导的H3K27乙酰化激活METTL3转录

研究者们先用UCSC genome bioinformatics site网站分析了METTL3启动子的修饰状态,发现启动子区存在着大量H3K27乙酰化。众所周知H3K27乙酰化由P300/CBP复合物催化。TCGA数据显示P300 mRNA表达在胃癌中显著上调,CBP的表达却无明显变化。研究者们又用C646(一种靶向P300的组蛋白乙酰基转移酶抑制剂)处理了胃癌细胞系HGC-27,发现METTL3的表达出现了大幅下降,降幅与处理时间长短和C646剂量有关。这一结果在另外两个胃癌细胞系中得到了证实。Western blot实验显示,C646处理后,H3K27乙酰化和METTL3蛋白质水平均下降。两种特异性siRNA直接敲减P300的实验发现,METTL3的mRNA和蛋白质水平均显著下降。另外,染色质免疫共沉淀(ChIP)结果显示,METTL3的启动子区有大量P300结合和H3K27乙酰化信号,P300的敲减可显著下调METTL3启动子区的H3K27乙酰化信号。这些数据说明,可能是P300介导的METTL3启动子区H3K27乙酰化诱导了METTL3的上调。

图2 P300介导的H3K27活化促进METTL3转录。(A)UCSC基因组数据显示METTL3启动子区存在大量H3K27乙酰化。(B-D)qRT-PCR测定C646处理过的HGC-27、NCI-N87、SGC7901细胞中METTL3 mRNA含量。(E)western blotting测定C646处理过24h的HGC-27、NCI-N87细胞中METTL3和H3K27乙酰化蛋白质含量。(F)western blotting验证NCI-N87细胞中P300敲减效率。(G)qRT-PCR分析P300敲减后NCI-N87细胞中METTL3表达。(H)western blotting测定P300敲减后NCI-N87细胞中METTL3和H3K27乙酰化蛋白质含量。(I, J)ChIP实验测定P300结合水平(I)以及H3K27乙酰化富集情况。(K)P300介导的H3K27乙酰化诱导METTL3转录的机制。

METTL3促进胃癌增殖和血管生成

研究者们建立了稳定过表达METTL3的胃癌细胞系BGC823和AGS,以研究METTL3的功能。他们发现,METTL3表达的上调能够显著促进胃癌细胞在琼脂糖凝胶平板上的克隆形成。接下来,研究者们又探索了METTL3促进胃癌细胞增殖的机制,他们构建了表达METTL3野生型和突变型的质粒(aa395-398和DPPW→APPA),发现在BGC823细胞系中,与转化了野生型METTL3的细胞相比,转化了突变型METTL3的细胞m6A水平显著降低。这一步的实验结果说明,METTL3的甲基化活性在其促BGC823细胞系克隆形成的作用中必不可少。

研究者们也建立了稳定敲减METTL3的胃癌细胞系HGC-27和NCI-N87,细胞中的m6A水平随后显著降低。琼脂糖凝胶平板实验显示,克隆形成数量显著减少。研究者们又在移植瘤动物模型中验证了METTL3的作用,结果显示与对照组相比,METTL3的过表达显著促进了肿瘤的生长。另外,免疫组化结果显示,METTL3过表达组中,Ki-67的表达增加。CD31染色实验结果显示,与对照组相比,METTL3过表达组微管数量显著增加。为了更深入地探索胃癌血管生成过程中METTL3的功能,研究人员在体外实验中研究了人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)的生长状况和微管形成。他们发现,与对照组相比,在过表达METTL3的BGC823细胞生长过的条件培养基中,HUVEC的生长和微管形成都显著增加;而过表达突变型METTL3的AGS细胞生长过的条件培养基则无此影响。与之类似的是,敲除了METTL3的HGC-27细胞生长过的条件培养基中,HUVEC的生长和微管形成受到了抑制。研究者们还从三位胃癌患者身上取细胞构建类器官,以验证METTL3潜在的临床价值。结果显示,在三个类器官中,METTL3均显著促进了胃癌细胞增殖。研究者由此得出结论:METTL3可能作为原癌基因借助其m6A催化活性,促进胃癌细胞增殖和血管生成。

图3 METTL3在体外和体内均能促进胃癌细胞增殖和血管生成。(A)western blotting测定过表达METTL3的细胞系中的METTL3蛋白质含量。(B)平板测定过表达METTL3的细胞系的生长情况。(C)METTL3的过表达提高了AGS细胞的克隆形成能力。(D)western blotting测定野生或突变型METTL3过表达的细胞中的METTL3蛋白质含量(左),抗m6A抗体dot blot分析野生或突变型METTL3过表达的细胞中的METTL3 mRNA含量(右)。(E)平板测定野生或突变型METTL3过表达的细胞的克隆形成能力。(F)western blotting测定敲除METTL3的细胞中的METTL3蛋白质含量(上),抗m6A抗体dot blot分析敲除METTL3或野生型细胞中的METTL3 mRNA含量(下)。(G)平板测定敲除METTL3的细胞系的生长情况。(H)敲除METTL3后,细胞的克隆形成能力受到了抑制。(I)METTL3的过表达有效促进了移植瘤在裸鼠体内的生长。(J)肿瘤体积和生长曲线。(K)20天后的瘤重。(L)抗Ki-67和抗CD31抗体IHC染色。(M)用过表达METTL3或对照组的细胞生长过的条件培养基培养HUVEC的微管形成和细胞生长测定。(N)转染过表达METTL3的质粒或对照慢病毒的三个胃癌类器官。

METTL3在体外和体内实验中均促进胃癌转移

研究者们首先在体外迁移和侵袭实验中探索了METTL3在胃癌转移中的作用,结果显示METTL3能够促进BGC823和AGS细胞的迁移和侵袭,且突变型METTL3的过表达对胃癌细胞的迁移和侵袭无明显影响。在HGC-27和NCI-N87细胞中敲除或敲减METTL3后,细胞迁移和侵袭受到抑制。小鼠体内实验中,过表达METTL3的BGC823荧光素酶细胞生物发光实验以及肝转移病灶的数量和大小均显示,表达上调的METTL3显著促进了胃癌的肝转移。而在METTL3表达受到抑制的NCI-N87细胞中,胃癌的肝转移也受到了明显抑制。这些结果显示,METTL3在促进胃癌转移的过程中具有关键作用。

图4 METTL3在体外和体内均促进胃癌转移。(A-C)细胞迁移和侵袭能力测定。(A)BGC823细胞。(B)AGS细胞。(C)HGC-27细胞。(D-F)METTL3的过表达显著促进了裸鼠中胃癌的肝转移(n=6)。(G, H)METTL3的敲减显著抑制了裸鼠中胃癌的肝转移(n=6)。

METTL3介导的HDGF mRNA的m6A修饰维持其依赖于IGF2BP3的稳定性

研究者对稳定过表达和敲除METTL3的胃癌细胞进行了RNA测序(RNA-seq),并对稳定过表达METTL3和对照组细胞进行了m6A修饰的RNA免疫共沉淀测序(MeRIP-seq),以探索METTL3促进胃癌进展的机制。RNA-seq结果显示,过表达METTL3的细胞中,有3806个转录本数目显著上调;敲除了METTL3的细胞中,有2346个转录本数目显著下调。MeRIP-seq结果显示,9930个转录本的m6A修饰增加。其中3个转录本的数量在RNA-seq和MeRIP-seq结果中均出现了增加,它们分别来自不同的基因:HDGF、C12orf45和CDKN2A。接下来,研究者们分别在过表达(BGC823和AGS)和敲除或敲减(HGC-27和NCI-N87)METTl3的细胞系中验证了这3个基因的mRNA水平,发现只有HDGF的mRNA水平随METTL3水平的变化而变化。Western blot实验也证实,在不同的胃癌细胞系中,HDGF水平受到METTL3的正向调控。而且,过表达突变型METTL3在mRNA和蛋白质水平上均不能影响HDGF水平。另外,与对照组相比,在过表达METTL3的BGC823细胞生长过的条件培养基中,HDGF水平显著上升,而含突变型METTL3的细胞生长过的条件培养基无此影响。同理,在敲除了METTL3的HGC-27细胞生长过的条件培养基中,HDGF水平亦下降。如Fig 5G所示,细胞质和细胞核中均含有HDGF,敲除METTL3后,这两处的HDGF水平均有所下降。另外,METTL3的过表达可导致胃癌肝转移灶上HDGF染色印迹增加,敲减METTL3后HDGF染色印迹显著减少。

MeRIP-seq结果显示,过表达METTL3时免疫纯化的RNA中富含AGACC序列,且HDGF mRNA的m6A修饰显著增加。AGACC和GAACA序列均位于HDGF的外显子。MeRIP-qPCR验证了测序结果,PCR结果显示与IgG对照抗体相比,过表达METTL3时, m6A特异性抗体与HDGF mRNA结合显著;敲除METTL3时结合减少。随后,研究者们验证了m6A修饰能否影响HDGF mRNA的稳定性。他们用放线菌素D(一种转录抑制剂)处理了胃癌细胞。结果显示,METTL3过表达时,HDGF mRNA更加稳定,敲除METTL3后结果相反。最近有研究表明,IGF2BP蛋白质(包括IGF2BP1/2/3)是一个m6A reader家族,它们通过识别m6A序列靶向成千上万个mRNA转录本,HDGF是其靶点之一。因此,研究者们选取了IGF2BP1/2/3研究它们对HDGF mRNA稳定性的影响。他们设计了两个靶向每个IGF2BP1/2/3靶点的特异性siRNA并验证了它们的敲减效率,发现只有敲减IGF2BP3能够显著抑制HDGF mRNA的表达,IGF2BP1/2无此作用。如Fig 5M所示,与对照组IgG抗体相比,RIP-qPCR中IGF2BP3特异性抗体在HDGF mRNA上富集显著。接下来,研究人员比较了28个胃癌组织和TCGA数据库中HDGF和IGF2BP3的水平,结果显示与癌旁组织相比,它们在胃癌组织中的表达均显著上调。同时,研究人员也发现,METTL3和IGF2BP3的表达与HDGF表达显著相关。动物移植瘤模型也证实了HDGF和IGF2BP3的作用,敲减METTL3、HDGF和IGF2BP3能够显著抑制肿瘤的生长。以上数据显示,METTL3介导的m6A修饰通过被IGF2BP3识别提高HDGF mRNA稳定性,上调HDGF表达。

图5 METTL3介导的HDGF mRNA的m6A修饰维持其依赖于IGF2BP3的稳定性。(A)RNA-seq和MeRIP-seq鉴定METTL3稳定过表达和敲除细胞中表达变化的基因。(B-C)qRT-PCR检测METTL3过表达(B)和敲除(C)细胞中HDGF mRNA水平。(D)western blotting检测METTL3过表达和缺乏细胞中蛋白质水平。(E)western blotting检测过表达野生型或突变型METTL3细胞中HDGF蛋白质水平。(F)ELISA实验测定生长过野生型或突变型METTL3过表达细胞的条件培养基中的HDGF水平。(G)免疫荧光实验检测METTL3野生型和突变细胞中HDGF的表达和定位。(H)BGC823细胞中m6A修饰的全局分析和m6A修饰最普遍的前1000个序列分析。(I)MeRIP-seq检测细胞中HDGF mRNA的m6A丰度。(J)MeRIP-qPCR分析METTL3介导的HDGF mRNA的m6A修饰。(K)qRT-PCR定时检测放线菌素D处理后METTL3过表达、敲除以及相应对照组细胞中HDGF表达水平。(L)qRT-PCR检测IGF2BP3敲减细胞中的HDGF mRNA水平。(M)RIP-qPCR检测与HDGF mRNA的m6A修饰位点结合的IGF2BP3水平。(N)qRT-PCR检测胃癌和相应正常胃粘膜中HDGF的表达水平。(O)TCGA数据库中胃癌(n=413)和正常胃粘膜(n=32)组织中HDGF的表达水平。(P)qRT-PCR检测胃癌和相应正常胃粘膜组织中IGF2BP3的表达水平(n=28)。(Q)TCGA数据库中胃癌(n=413)和正常胃粘膜(n=32)组织中IGF2BP3的表达水平。(R, S)METTL3(R)和IGF2BP3(S)表达与胃癌中HDGF表达正相关(线性回归)。(T)裸鼠中METTL3、HDGF、IGF2BP3的敲除能够有效抑制NCI-N87胃癌细胞生长。(U)肿瘤体积/生长曲线。(V)21天后的瘤重(三个平行实验,平均值±SEM)。

METTL3上调HDGF表达加速胃癌恶性进展

为进一步研究胃癌中HDGF的致癌功能,研究者们设计了三个不同的siRNA去靶向HDGF并通过qRT-PCR和western blotting验证其敲减效率。HDGF的敲减大幅抑制了克隆形成、细胞迁移和侵袭,以及HUVEC生长和微管形成。另外,HDGF重组蛋白(rHDGF)回复了敲除HDGF的胃癌细胞的克隆形成能力。研究者们敲减了过表达METTL3的AGS细胞中的HDGF,这显著抑制了METTL3介导的胃癌细胞迁移和侵袭,但是rHDGF回复了敲除METTL3的胃癌细胞的迁移和侵袭能力。另外,HDGF抗体能够阻断METTL3过表达引起的HUVEC生长和微管形成,而rHDGF也能够回复这两个过程。还有,HDGF敲减后,体内METTL3引起的胃癌细胞生长和血管生成受到显著抑制。因此,以上数据证明,METTL3通过上调HDGF表达促进胃癌恶性进展。

图6 METTL3上调HDGF表达加速胃癌恶性进展。(A)qRT-PCR(上)和western blot(下)验证HDGF敲减效率。(B)HDGF的敲减影响了细胞的克隆形成能力。(C)HDGF的敲减影响了细胞的迁移和侵袭能力。(D)生长于HDGF表达不足和对照组细胞生长过的条件培养基的HUVECs的微管形成实验。(E)加入人rHDGF或PBS的敲除METTL3的细胞克隆形成能力测定。(F)转染HDGF siRNAs或对照的过表达METTL3的细胞迁移和侵袭能力测定。(G)裸鼠中HDGF的敲减抑制了METTL3介导的肿瘤生长。(H)肿瘤体积/生长曲线。

METTL3通过HDGF活化的GLUT4和ENO2表达促进胃癌细胞中糖酵解

糖酵解是肿瘤中的基础代谢标志之一。RNA测序数据表明,很多代谢途径,尤其是糖酵解和糖异生均与METTL3过表达时的胃癌进展相关。因此研究者们验证了METTL3是否通过调节糖酵解过程促进胃癌恶性进展。如Fig 7A和B中所示,BGC823细胞中METTL3表达的上调显著促进了葡萄糖摄取和乳酸生成。相反,敲除HGC-27细胞中的METTL3后这两个过程均受到显著抑制。研究者们又将过表达HDGF的质粒转化进入敲除METTL3的细胞,结果发现HDGF的过表达能够回复细胞的糖酵解和乳酸生成过程。胞外酸化动力学参数也显示,过表达METTL3的BGC823细胞中糖酵解活性增加,敲除METTL3后糖酵解活性降低。研究者们又研究了一组糖代谢相关基因在METTL3过表达和敲除细胞中的转录情况,以及它们与HDGF的关系。结果发现,只有GLUT4和ENO2基因表达因METTL3表达的上调而上调,因METTL3或HDGF的敲除/敲减而下调。此外,他们还研究了HDGF能否在转录水平上激活GLUT4和ENO2的表达。ChIP实验显示,HDGF直接与GLUT4和ENO2的启动子区(不包括HK2启动子)相结合。IHC结果显示,METTL3的过表达导致AGS移植瘤模型中HDGF、GLUT4和ENO2染色印迹增加,而敲减HDGF后GLUT4和ENO2表达显著减少。总之,这些实验结果显示,METTL3/HDGF通过糖酵解途径促进肿瘤发生和肝转移。

图7 胃癌细胞中METTL3-HDGF轴靶向作用于GLUT4和ENO2促进糖酵解。(A, B)METTL3过表达引起的糖摄取(A)和乳酸生成(B)。(C)HDGF的过表达回复了敲除METTL3的细胞中的乳酸生成。(D, E)METTL3过表达(D)或敲除(E)的细胞外酸化参数监测。(F, G)qRT-PCR检测出GLUT4和ENO2表达量与METTL3/HDGF轴作用相关。(H)ChIP实验检测HDGF分别与GLUT4、ENO2和HK2启动子结合的能力。(I)IHC染色分别检测METTL3过表达或METTL3过表达+HDGF敲减的细胞中抗METTL3、HDGF、GLUT4和ENO2抗体。(J)IHC染色检测METTL3敲减的细胞中抗METTL3、HDGF、GLUT4和ENO2抗体。

接下来研究者们又研究了METTL3/HDGF轴在促糖酵解和肿瘤血管生成过程中的临床意义。他们检查了METTL3、HDGF、GLUT4、ENO2和CD31在胃癌组织中的表达情况。在54例胃癌患者中,METTL3的表达与HDGF、CD31、GLUT4和ENO2表达呈正相关。另外,在线生信工具Kaplan-Meier Plotter显示,GLUT4和ENO2 mRNA水平升高的胃癌患者,其OS更短。这些数据显示,METTL3/HDGF轴促胃癌进展的作用与糖酵解和血管生成部分相关。

图8 人胃癌中METTL3/HDGF轴在促进肿瘤血管生成和糖酵解中的临床意义。(A, B)54个人原发胃癌样本中METTL3水平与HDGF、CD31、GLUT4和ENO2表达显著相关。(C)METTL3调控肿瘤糖酵解和血管生成,促进胃癌细胞生长和肝转移。

本文阐述了HDGF mRNA的甲基化能够促进胃癌的发生发展。目前,科学家们已经发现人类RNA中有超过100种化学修饰,其中m6A修饰在mRNA和非编码RNA中最为常见。最近有一系列研究发现,m6A修饰与许多疾病相关,例如二型糖尿病、癌症、病毒感染和心力衰竭。此修饰由甲基转移酶、去甲基化酶和m6A reader调控,并进一步影响RNA的生物学功能。也有研究指出,m6A修饰在多种恶性肿瘤的进展过程中都发挥了重要的作用。基于此,METTL3得到了广泛的研究。已有研究报道,它能够促进肝细胞肝癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤和急性髓系白血病的进展。在本文中,研究者们报道了H3K27能够活化METTL3的转录,上调它在胃癌中的表达。之后,METTL3促进胃癌细胞中RNA的m6A修饰,对患者预后造成不良影响。研究者提出,METTL3可能成为胃癌诊断的分子标志物。略美中不足的是,肠型和弥漫型胃癌患者中METTL3的表达并未显示出显著差异。体外和体内实验均证实,METTL3通过其m6A修饰催化活性促进胃癌细胞生长和转移。因此,还可考虑将METTL3视为胃癌的治疗靶点之一。

研究者们又借助测序实验发现,胃癌细胞中HDGF是METTl3调控作用中关键的下游靶点。它是一种新发现的生长因子,据报道也与多种肿瘤细胞活动相关,例如生长、凋亡、血管生成和转移。后续实验还发现,GLUT4和ENO2是METTl3/HDGF轴的靶点,这两个分子均参与糖酵解过程。

综上,本研究发现了METTL3在胃癌发生、发展中的作用,并揭示它通过调控下游HDGF、GLUT4和ENO2,影响糖酵解和血管生成,最终促进肿瘤发生和转移。考虑到METTL3在胃癌组织中高表达且与不良预后相关,因此未来可将其用作胃癌诊断标志物以及治疗靶点。

参考文献:Wang Q, et al. METTL3-mediated m6A modification of HDGF mRNA promotes gastric cancerprogression and has prognostic significance. Gut. 2019 Oct 3. pii: gutjnl-2019-319639. doi: 10.1136/gutjnl-2019-319639.

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