新型近红外光疗剂促进的肿瘤免疫原性光疗

2019-10-24 常笑医学网

摘要:由近红外(NIR)染料介导的光动力疗法(PDT)是一种有前途的肿瘤治疗方法。然而,由于低氧肿瘤微环境和光敏剂的自我猝灭等问题使其应用受到很大的限制。进而,无法在在诱导免疫原性细胞死亡(ICD)和触发有效的全身性抗肿瘤免疫应答中发挥应有的作用。这项研究表明,NIR染料在纳米载体中以分子形式进行分散可以显著增强其产生活性氧的能力,并增强在肿瘤治疗中PDT和光热疗法的协同作用。特别是,NIR染料吲哚菁绿(ICG)可通过π-π共轭自发吸附到共价有机骨架(COF)上,以防止其分子间的堆叠相互作用。然后,将ICG负载的COF超声剥落并用聚多巴胺(PDA)涂覆,构建具有增强肿瘤治疗效果的新型光疗剂ICG @ COF-1 @ PDA。在一次NIR激光照射下,新型光疗剂ICG @ COF-1 @ PDA可诱导明显的ICD,并在结直肠癌中产生抗肿瘤免疫力,并产生62.9%的远处未治疗肿瘤的抑制率。ICG @ COF-1 @ PDA还具有针对4T1小鼠乳腺至肺转移(三阴性癌症(TNBC)的自发转移方式)肿瘤的光疗功效。总而言之,这项研究揭示了一种用于NIR染料以分子形式分散的新型纳米传递系统,该系统可为针对原发性和转移性肿瘤的治疗提供新的机会。

1. 研究背景

光疗和放射疗法等局部疗法具有增强全身免疫反应并使未治疗的远处转移灶消退的作用。其中,免疫原性细胞死亡(ICD)在启动免疫应答中起着至关重要的作用。研究表明,即将死亡的细胞将经历ICD,并释放抗原和免疫佐剂,从而增强了抗原呈递细胞(APC)的聚集和激活。

包括光动力疗法(PDT)和光热疗法(PTT)在内的光疗已被广泛认为是治疗恶性肿瘤的一种有效方法。例如,PDT可以通过产生活性氧(ROS)引起氧化应激来诱导ICD;此外,PTT中使用的光热剂可将光转化为热量以产生高热,从而通过内质网应激触发ICD。然而,如果仅仅是PDT或PTT,不足以诱导免疫原性细胞死亡。例如,通过PDT产生的ROS经常会被光敏剂和缺氧的肿瘤微环境自猝灭,从而导致肿瘤抗原以及与损伤相关的分子(DAMPs,例如HSP70和HMGB1)释放不足。对于PTT来说,存在用于诱导ICD的最佳热“窗口”。 PTT诱导产生较高的温度使细胞立即死亡,而DAMPs释放不足,而较低温度对肿瘤细胞杀伤或DAMPs释放几乎没有影响。然而,由于血管的冷却作用和光热剂分布不均匀,在PTT治疗过程中很难精确地控制整个肿瘤组织的温度。综上考虑,每种类型的光疗都有其自身的缺陷,无法满足ICD的条件。因此,研究人员将PTT和PDT组合使用,两者的协同作用可以诱导明显的ICD并引发免疫反应。

由于吲哚菁绿(ICG)等近红外(NIR)染料具有优异的光学性能而赋予了其在PDT和PTT中的应用价值。然而,由于它们的半衰期极短且在肿瘤部位的积累性差,通常需要使用纳米载体来递送这些NIR染料。另一方面,大多数由常规纳米材料(例如白蛋白、脂质体)制成的纳米粒子是无序的,导致光敏剂在纳米粒子内聚集并极大地降低了它们产生单线态氧的能力。因此,迫切需要开发一种可以有效防止光敏剂聚集的分子分散的NIR染料,从而增强PDT / PTT双模式新型纳米载体的肿瘤治疗效果。

二维纳米材料作为一个新兴领域,引起了研究者们的广泛的关注。二维材料在光电子学、气体存储和催化等方面有着巨大的潜在应用价值,值得进一步发展。在催化领域,二维材料通常用于催化剂的分散,可有效防止催化剂分子的聚集。最近,共价有机框架(COFs)作为一类有机聚合物,因其低密度,高热稳定性,出色的生物相容性和可生物降解性等特性而备受关注。因此,研究人员想知道是否可以使用二维COFs将NIR光敏剂进行分子分散而不影响其光动力/光热特性。与催化和气体吸附等领域相比,COF在体内递送中的应用仍处于起步阶段,受此启发,作者采用COF来分散和递送NIR染料用于光免疫疗法。

作者根据已公开的实验方法,用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)稳定COF并获得块状COF-1,然后首次将包括ICG在内的近红外染料以高亲和力吸附到块状COF-1上,并通过简单的超声剥离制备得到ICG @ COF-1纳米片。 为了进一步提高其体内稳定性和循环时间,将聚多巴胺(PDA)膜和聚乙二醇(PEG)依次沉积在ICG @ COF-1的表面上,制备得到最终的光疗剂纳米片。

1(a)ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的制造过程和(b)光免疫治疗活性的示意图

2. 研究结果

为了使ICG @ COF-1具有良好的生理稳定性和较长的循环时间,将PDA膜和PEG依次沉积在ICG @ COF-1的表面上,以获得深褐色的ICG @ COF-1 @ PDA纳米片(图2a)。ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的直径约为170 nm(图2b)。图2c所示的紫外-可见光谱表明,PDA的沉积并未明显改变802 nm处ICG @ COF-1的主峰。此外,作者研究了ICG @ COF-1 @ PDA纳米片在体外的PDT / PTT双模式光疗效果。在NIR激光照射下,与游离ICG相比,单线态氧传感器(SOSG)检测到由ICG @ COF-1纳米片产生的单线态氧(1O2)大幅增加。尽管ICG @ COF-1 @ PDA纳米片中1O2的生成在PDA沉积后部分减少,但仍高于游离的ICG(图3d),ICG @ COF 1 @ PDA产生的1O2比游离ICG高6.9(10 µg mL-1 ICG)至9.3倍(25 µg mL-1 ICG),这主要是由于NIR染料的分子分散性,使其无分子间堆积(尤其是在高浓度下)。这种高效的ROS生成能力可增强ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的光动力活性。

为了评价纳米片的光热性能,作者监测了近红外激光(808 nm)照射时的温度变化。与游离ICG(ΔT= 4.8°C)和空白COF-1 @ PDA(ΔT= 9.3°C)相比,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的温度(ΔT= 20.4°C)明显升高(图2e)。此外,还研究了ICG @ COF-1 @ PDA的光稳定性(图2f)。与COF-1 @ PDA和游离ICG的物理混合物相比,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片在开/关NIR激光四个循环照射后仍具有很强的加热能力。上述结果表明,PDA涂层可显著延迟ICG的光降解。因此,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片可在NIR激光照射下同时产生足够的高温和单线态氧,使其在PDT / PTT双模式治疗中的具有可行性。

2 ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的制备和表征

随后,作者评价了CT26大肠肿瘤细胞中ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的细胞内摄取能力。如图3a所示,用ICG @ COF-1 @ PDA处理的细胞在孵育2 h后由于ICG的存在而显示出明显的红色荧光,主要与溶酶体指示剂共定位。 之后,以2', 7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)为探针,检测ICG @ COF-1 @ PDA在有或没有NIR激光照射下诱导的细胞内ROS的产生。在NIR激光照射下,在H2DCFDA存在的情况下,用ICG @ COF-1 @ PDA处理的CT26肿瘤细胞比游离ICG发出的荧光强度更高。在没有激光照射的任何一组细胞中,均未检测到明显的ROS信号(图3b)。

然后,作者评价了ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的光细胞毒性。分别用钙黄绿素乙酰氧基甲基酯(calcein-AM)和碘化丙锭(PI)将肿瘤细胞进行染色,分别标记活细胞和死细胞。如图3c所示,在没有激光照射下的两组细胞均显示出绿色荧光,这表明ICG @ COF-1 @ PDA或游离的ICG在黑暗中对肿瘤细胞无毒性。当用808 nm的激光照射时,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片处理的肿瘤细胞大面积死亡,被PI荧光染色发出红色荧光,而游离的ICG处理的细胞则具有较高的存活率。此外,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)定量地评价了ICG @ COF 1 @ PDA纳米片的体外光细胞毒性。在黑暗中未观察到对CT26肿瘤细胞明显的细胞毒性,说明该纳米片具有良好的生物相容性。在NIR激光照射下,ICG @ COF-1 @ PDA通过PDT / PTT双模光疗以剂量依赖性的方式有效地杀死肿瘤细胞,具有比游离ICG和COF-1 @ PDA更强的光细胞毒性(图3d)。

3 体外ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的细胞摄取能力和增强的光细胞毒性

在超低附着的圆底96孔板中建立CT26肿瘤细胞球体,用于评价ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的组织穿透能力。孵育8小时后,ICG @ COF 1 @ PDA纳米片主要位于肿瘤球体的边缘区域。孵育12 h和24 h后,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的红色荧光逐渐地分布在整个球体中,促进了纳米片介导的双模式光疗(图4a)。50 µm切片中的动态荧光强度和平均荧光强度同样也表明了通过球体穿透的时间依赖性(图4b,c)。

此外,还研究了3D肿瘤细胞球体中NIR激光辐照后ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的单线态氧生成能力。与ICG @ COF-1 @ PDA纳米片孵育24 h后,对球体进行NIR激光照射1 min。与纳米片的分布轮廓不同,深度为50 µm的椭球中H2DCFDA的绿色荧光(ROS指示剂)仅出现在边缘,而核心区域则无荧光(图5d,e)。上述结果表明3D球体的核心缺氧,这对光动力疗法极为不利。因此,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片将氧依赖性的PDT与氧不依赖性PTT结合可提高光疗的效果。

4 ICG @ COF-1 @ PDA在3D肿瘤细胞球体中的渗透曲线和ROS的生成

为了对光疗提供指导,使用体内成像系统(IVIS)对游离ICG和ICG @ COF-1 @ PDA纳米片进行了NIR荧光成像。如图5a所示,肿瘤区域中来自ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的ICG荧光随时间逐渐增强,并在24 h达到最大值。因此,在注射24 h后,获取肿瘤和其它正常器官用于离体成像(图5b)。用ICG @ COF-1 @ PDA纳米片治疗的肿瘤的荧光强度大约是用游离ICG治疗的肿瘤的荧光强度的三倍(图5c)。不同的生物分布图表明,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片具有较长的循环时间和优异的肿瘤富集能力。此外,还评价了纳米片的体内光热效应。根据以上结果,在静脉内注射24 h后,用NIR激光照射用ICG @ COF-1 @ PDA纳米片或游离ICG处理过的小鼠的荷瘤区域。红外热图像(图5d)显示,用ICG @ COF-1 @ PDA纳米片治疗的肿瘤温度在激光照射的前1 min内迅速升高,在5 min后达到53.2oC。相反地,用游离ICG或COF-1 @ PDA治疗的肿瘤在用808 nm激光辐照后仅出现了轻微的温度升高现象(图6e)。

5 NIR激光照射后ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的生物分布和体内红外热成像

作者在体内也证实了ICG @ COF 1 @ PDA纳米片具有理想的双模式光疗效果,并评价了CT26大肠肿瘤模型的体内光毒性。当肿瘤达到100 mm3大小时,将小鼠随机分为六组,包括:盐水,COF-1 @ PDA和ICG @ COF-1 @ PDA纳米片(有或没有NIR激光照射组)。肿瘤生长曲线如图6a所示,单独使用COF-1 @ PDA,ICG @ COF-1 @ PDA或仅使用NIR激光照射并不会影响肿瘤的生长。激光照射后,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片介导的PTT / PDT双模式光疗,具有明显的治疗效果。在14天的监测期内,所有肿瘤逐渐消退并完全消融且无复发。同时,所有实验组小鼠的体重均无明显变化(图6b),表明ICG @ COF-1 @ PDA纳米片具有良好的生物相容性。在第14天通过肿瘤组织切片进一步评估了ICG @ COF 1 @ PDA纳米片的抗肿瘤效果(图6c)。在H&E染色的图片中,根据肿瘤生长趋势,在ICG @ COF-1 @ PDA + NIR组中观察到了严重的细胞损伤,而在对照组中未发现明显的病变。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色也显示与其它处理相比,ICG @ COF 1 @ PDA + NIR诱导的细胞凋亡最多。Ki67的免疫化学染色表明,ICG @ COF-1 @ PDA + NIR组明显地抑制了肿瘤细胞的增殖。据报道,某些肿瘤疗法,如热疗,光动力疗法和放射疗法,可诱导抗肿瘤免疫反应,因此,作者在ICG @ COF-1 @ PDA + NIR组中观察到肿瘤消退后继续监测小鼠7天,在这期间小鼠保持无肿瘤,无复发。将这四只小鼠再次被肿瘤细胞攻击。给所有用ICG @ COF 1 @ PDA + NIR治疗的小鼠注射1.5×105肿瘤细胞,这四只小鼠中的两只保持无肿瘤状态(图6d)。上述结果表明,基于ICG @ COF-1 @ PDA的双模式光疗对原发肿瘤具有明显的治疗效果,并可诱导全身性抗肿瘤免疫。

6 ICG @ COF 1 @ PDA对CT26荷瘤小鼠的PDT / PTT双模式光疗的治疗效果和免疫激活性

基于ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的双模式光疗具有针对肿瘤复发的免疫记忆的潜力,因此作者试图阐明用于抑制转移的机制。采用双侧结直肠肿瘤模型研究基于ICG @ COF-1 @ PDA的双模式光疗的免疫激活作用(图7a)。分析了ICG @ COF 1 @ PDA介导的光疗对CT26肿瘤中危险相关的分子模式(DAMP)的影响。在NIR激光照射24 h后,经ICG @ COF-1 @ PDA治疗的肿瘤中HSP70和HMGB1均明显上调(图7b)。为了进一步研究光疗对树突状细胞(DC)成熟的影响,在治疗3天后收集肿瘤引流的淋巴结进行流式细胞术分析。用ICG @ COF-1 @ PDA + NIR治疗的小鼠的DC成熟度(CD11c + CD80 + CD86 +)为32.8%,明显高于生理盐水+ NIR或游离ICG + NIR组(图7c)。而没有NIR激光照射的ICG @ COF-1 @ PDA纳米片本身无法诱导DC成熟。上述结果表明,基于ICG @ COF-1 @ PDA的PDT / PTT双模式治疗可诱导针对远端肿瘤或转移的全身免疫反应。如图7d所示,基于ICG @ COF-1 @ PDA的光疗可彻底根除所有动物的原发性肿瘤,而游离ICG介导的光疗对肿瘤生长的影响则可忽略不计。上述增强的治疗效果主要归因于PDT和PTT的结合,以及纳米片在肿瘤组织中具有良好的富集能力。此外,ICG @ COF-1 @ PDA + NIR治疗还明显减慢了未经治疗的远端肿瘤的生长,肿瘤抑制率为62.9%(图7e)。相反地,与对照组相比,基于游离ICG的光疗对远端肿瘤则没有明显的治疗效果。同时,流式细胞仪数据表明,ICG @ COF 1 @ PDA介导的光疗显著地促进了CD8 + T渗透到远端肿瘤中。在ICG @ COF-1 @ PDA + NIR处理后,免疫荧光图像也清楚地显示出远端肿瘤中浸润的CD8 + T细胞的增加(图7f,g)。此外,经ICG @ COF-1 @ PDA + NIR治疗后,远端肿瘤中的干扰素γ(IFN-γ)水平也明显升高(图7h)。 ICG @ COF-1 @ PDA介导的PTT / PDT双模式光疗可产生大量的DAMPs来启动全身性的免疫反应,从而具有优异的抗肿瘤效果。

7 ICG @ COF-1 @ PDA诱导的PDT / PTT双模光疗引发了针对原发性和远端未治疗肿瘤的全身性抗肿瘤免疫反应

肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因,成为传统癌症治疗(如手术、化学疗法和放射疗法)中面临的巨大挑战。基于上述结果,作者证明了ICG @ COF-1 @ PDA介导的光疗可消除大型原发肿瘤并通过释放“危险信号”诱导全身性抗肿瘤免疫反应。随后,作者为了确定这种双模式光疗方法所诱导的综合作用是否可抑制自发性三阴性乳腺癌的转移(4T1)转移模型,进行了如图8a所示的处理。与CT26大肠肿瘤模型相似,ICG @ COF-1 @ PDA + NIR治疗具有最明显的治疗效果,而体重则没有明显变化。近红外激光照射后,该组肿瘤被完全消融(图8b,d)。同样,肿瘤切片的H&E染色,TUNEL荧光染色和Ki67免疫组织化学染色结果表明ICG @ COF-1 @ PDA + NIR处理可诱导大量细胞凋亡,并明显降低肿瘤细胞的增殖。治疗14天后,通过手术仔细清除所有实验组的原发肿瘤。原发肿瘤的重量与肿瘤生长曲线一致(图8c)。连续监测小鼠的生活状况和体重发现用ICG @ COF-1 @ PDA + NIR治疗的所有小鼠均存活至少53 d,且体重没有明显下降。处死小鼠后,仔细收集肺和肝脏后进行进一步的检查。肺组织的照片(图8e)显示,在用ICG @ COF-1 @ PDA + NIR激光照射的小鼠中,只有零星的转移灶,而在其它三组的小鼠中则可以观察到大量的转移灶(图8f)。 H&E染色图像显示,ICG @ COF-1 @ PDA + NIR在激光照射后,肺组织中没有明显的转移灶,而其它组的肺组织中则广泛存在转移灶(图8g)。肝脏是另一个常见的肿瘤转移部位,与其它组相比,ICG @ COF-1 @ PDA + NIR组的肝脏内没有明显的转移(图8g)。上述结果表明,基于ICG @ COF-1 @ PDA的PTT / PDT双模式光疗通过减轻现有肿瘤的负担和激活抗肿瘤免疫应答反应,可有效消融浸润性肿瘤并抑制肿瘤转移。

8 ICG @ COF-1 @ PDA诱导的双模式光疗具有抑制转移作用

3. 总结

PDT本身在血管周围区域是最有效的,而在缺氧的肿瘤组织中产生ROS的区域效率要低得多。另一方面,因受辐照组织或受辐照组织附近的血管对肝内短暂升高的温度具有相当大的冷却作用而使PTT的使用受到限制。因此,需要巧妙地将PTT和PDT结合使用,以同时消除血管附近和远离血管的肿瘤细胞。此外,对于PTT,存在一个引发ICD的最佳“热”窗口。一些研究表明,高温(40–65oC)能够诱导DAMPs暴露,激活树突状细胞并启动强大的免疫反应。尽管如此,仅产生高于65oC的温度或低于40oC的温度即可使低ICD标记物暴露于周围环境中。温度过高时,肿瘤细胞会立即受损,使DAMPs暴露或释放不足。当温度低于阈值时,对杀死肿瘤细胞或释放DAMP几乎没有影响。在这项研究中,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片介导的光疗在激光照射5 min后,将肿瘤温度升高到53.2oC,可诱导免疫原性细胞死亡的能力。作者构建的纳米片具有很强的穿透力,并在3D肿瘤球体内实现了均匀分布(图4a)。在NIR激光照射下,纳米片同时产生大量的热量和单线态氧,可诱导免疫原性肿瘤细胞死亡并引发全身性抗肿瘤免疫力(图7)。

为了提高光动力的活性,必须有效地分散包括ICG在内的NIR染料。ICG分子以高亲和力自发吸附到块状COF-1上。吸附和剥离后,由于π-π共轭作用ICG的主峰从779 nm明显红移至802 nm。此外,在ICG和COF-1结构后,ICG肩峰与主峰的比值明显降低,表明ICG分子之间的分子间相互作用力大大减轻。 为此,可以有利地证明ICG是分子分散在COF-1纳米片上,形成ICG @ COF-1。在NIR激光照射下,与游离ICG相比,ICG @ COF-1产生的单氧显著增加,为光免疫疗法提供了有效的载体。

除体重外,还通过对重要组织进行了组织学检查和血清生化分析,评估了ICG @ COF-1 @ PDA纳米片的体内毒理学。静脉注射2天和14天后,收集血液和主要器官进行分析。与对照组相比,肝功能(天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶)和肾功能(血尿素氮和肌酐)的标志物无明显差异,表明ICG @ COF-1 @ PDA对肝功能和肾功能无明显损害。此外,经ICG @ COF-1 @ PDA纳米片处理后,在主要组织(心脏,肝脏,脾脏,肺和肾脏)中未观察到明显的病理异常。上述实验结果验证了ICG @ COF-1 @ PDA纳米片在体外和体内应用中都具有明显的疗效和较高的治疗指数。

总之,作者通过简单的超声波剥落的方法制备了基于COF-1的纳米平台,该平台能够以高亲和力负载具有π键的药物。负载到ICG @ COF 1 @ PDA纳米片中的NIR染料ICG保留了其优异的光学性能,同时大大降低了自聚集,确保了其单线态氧和高热产生的能力。体内研究表明,ICG @ COF-1 @ PDA纳米片可有效诱导PTT / PDT的双模式光疗,从而使原发性肿瘤完全消退,并引发针对复发和转移的全身免疫反应。因此,该方法为用分子分散的NIR染料构建性能优异的纳米片用于抗肿瘤光免疫疗法开辟了新的可能性,提供了良好的平台。

Ref: Shaoju Gan, Xiaoning Tong, Yiqiao Hu,and Ahu Yuan, Covalent Organic Framework-Supported Molecularly Dispersed Near-Infrared Dyes Boost Immunogenic Phototherapy against Tumors. Adv. Funct. Mater. 2019, 1902757

(DOI: 10.1002/adfm.201902757)

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