通过泛素（UB）的蛋白修饰在所有真核细胞中起着枢纽调节作用。DUB分为六个家族：泛素特异性蛋白酶（USP），泛素羧基末端水解酶（UCH），卵巢肿瘤蛋白酶（OTU），马查多-约瑟夫病蛋白域蛋白酶（MJD），JAMM/MPN域-相关的金属肽酶（JAMMs），和单核细胞趋化蛋白诱导的蛋白（MCPIP）家族。通过调节泛素系统，我们出现了许多DUB作为癌症的重要的治疗靶点。

DUBs的OTU子家族已成为许多研究的重点，并在许多细胞过程中发挥了作用。例如，A20是NF-κB的调节器。具体而言，OTUD7B通过结合和去泛素化TRAF3来抑制TRAF3蛋白水解，从而防止异常的NF-κB活化。有人建议OTULIN裂解Met1连接的多聚泛素链以抑制线性泛素链组装复合体（LUBAC）介导的NF-κB信号传导。OTUD5，已经成为在多种细胞过程，包括DNA损伤修复，转录和先天免疫的关键调节靶点。先前的研究表明OTUD5通过抑制Ku80降解促进了DNA双链断裂（DSB）修复。OTUD5也已显示出通过调节受损染色质上FACT依赖性转录来调节DNA损伤反应。尤其是，OTUD5通过下调TRAF3的泛素化参与IFN-I表达的负调节。OTUD5通过阻断RORγt的UBR5介导的蛋白酶体降解抑制产生IL-17A。此外，OTUD5响应于依托泊苷，这是p53的稳定和活化的先决条件。然而迄今为止，OTUD5在肿瘤发生中的功能仍然未知。

三方基序（TRIM）蛋白构成包含RING域的蛋白的一个亚家族，包括E3泛素连接酶家族，它们共享一个包含一个RING域，一个或两个名为B-box的锌指结构域的保守N端结构。TRIM家族成员TRIM25，通过多种途径参与调节细胞增殖和迁移。T已显示TRIM25通过激活人类胃癌中的TGF-β途径起到癌基因的作用。此外据报道，TRIM25是位于乳腺癌转移相关转录网络中心的转录调节因子。TRIM25的耗竭彻底破坏了与转移相关的基因的表达。尽管越来越多的证据表明TRIM25在涉及肿瘤发生的关键途径中的作用，但TRIM25调节肿瘤进展的确切机制仍不清楚。

肿瘤抑制蛋白TRIM19，称为早幼粒细胞白血病蛋白（PML），形成称为PML核小体（PML-NBs）的大核聚集体。PML-NBS存在于几乎所有的人类细胞类型，并且显示为大分子球状结构。PML功能经常因染色体易位而丧失，这使患者更易患急性早幼粒细胞白血病（APL）。PML调节p53肿瘤抑制因子的稳定性和转录活性，PML也作为p53的转录靶点以增强其肿瘤抑制效果。IRF-8被证明是IFNγ诱导的PML表达的强制性调节剂。此外，PML的稳定性显示受Cullin3-KLHL20泛素连接酶介导的泛素调控。尽管PML对于关键的肿瘤抑制途径的活动至关重要，但是有效调控PML的机制仍然未知。

Nat Commun 11, 4184 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-17926-7

来自北京大学健康科学中心生物化学与生物物理系赵文辉教授的研究团队对这个问题提出了新的见解。研究小组发现，发现OTUD5敲低以TRIM25依赖性方式加速细胞生长。随后，发现OTUD5在体外和体内与TRIM25相互作用并去泛素化。此外OTUD5通过去泛素化TRIM25在转录调控和肿瘤抑制中起着以前未知的作用，从而导致PML的下调和较少的PML-NBs。最后他们评估了OTUD5在小鼠异种移植模型和人类癌症中的作用。综上所述，这项研究揭示了OTUD5-TRIM25轴的调控和功能，表明它是肿瘤治疗的潜在靶标。 研究成果发表在2020年8月21日出版的世界知名杂志《Nature Communications》上，题为《OTUD5 cooperates with TRIM25 in transcriptional regulation and tumor progression via deubiquitination activity》。

为了鉴定调节细胞增殖的OTU，通过短发夹RNA（shRNA）敲除筛选了14个人类的OTU DUB，并使用菌落形成试验确定了它们对细胞增殖的影响。shRNA的敲除效率通过实时PCR（RT-PCR）进行了验证。集落形成测定的结果表明，敲低14个OTU DUB中的8个减少了Hep3B细胞集落的数量，而敲除14个候选者中的3个则促进了Hep3B细胞的集落形成。消耗OTUD5的细胞形成的菌落几乎是对照形成的菌落的两倍（图1a，b）。

为了验证结果，设计了两种不同的小干扰RNA（siRNA）靶向人类OTUD5。然后使用两种不同的肿瘤细胞系Huh7和Hep3B来研究siRNA介导的OTUD5耗竭是否促进细胞增殖。Huh7和Hep3B细胞中的信使RNA（mRNA）和OTUD5的蛋白质水平都使用siRNA进行了充分敲低（图1c，d）。然后将细胞铺在培养皿上并培养十天以形成菌落。由OTUD5耗尽的细胞形成的菌落明显多于由对照细胞形成的菌落（图1e，f）。最后，所有耗竭OTUD5的Huh7细胞和Hep3B细胞均显示出比对照组更高的细胞增殖速率（图1g，h）。

图1 OTUD5敲低加速细胞生长

DUB通过在蛋白质复合物与配对E3泛素连接酶参与了各种途径和信令网络。为了测试OTUD5是否与E3泛素连接酶结合以调节细胞增殖，通过用表达pCIN4-Flag-OTUD5 48的质粒转染Hep3B细胞来建立稳定的Flag-OTUD5 / Hep3B细胞系。与OTUD5相互作用的细胞因子通过抗Flag抗体偶联的M2珠纯化。然后通过蛋白质印迹分析OTUD5复合物，验证TRIM25的存在（图2a）。通过Hep3B细胞裂解物的免疫沉淀（IP）证实了内源OTUD5和TRIM25之间的相互作用。在用抗OTUD5抗体获得的免疫沉淀物中很容易检测到TRIM25，但在对照IgG中却未检测到（图2b）。相反，内源性OTUD5用TRIM25特异性抗体免疫沉淀，但没有用对照抗体免疫沉淀（图 2c）。

OTUD5在多肽的中央区域具有OTU结构域，并且在保守的C末端具有泛素相互作用基序（UIM）（图 2d）。为了确定UIM在OTUD5和TRIM25之间相互作用中的重要性，用表达Flag标签的野生型OTUD5（Flag-OTUD5-WT）和Flag标签的OTUD5的质粒构建体转染了Hep3B细胞，并删除了UIM结构域（Flag-OTUD5 -ΔUIM）（图2e，f）。使用Flag-OTUD5-ΔUIM获得的TRIM25水平明显低于使用Flag-OTUD5-WT获得的TRIM25，这表明UIM域对于OTUD5与TRIM25之间的相互作用很重要。但是，一些TRIM25与Flag-OTUD5-ΔUIM共沉淀，表明UIM可能不是唯一的相互作用位点，并且TRIM25可能与OTUD5蛋白的其他部分结合（图2f）。

敲低TRIM25经常导致肿瘤生长。因此，测试了敲除OTUD5后增加的菌落形成是否由TRIM25介导。首先，使用两种不同的siRNA进行了TRIM25组合实验。结果显示，在Huh7和Hep3B细胞中，TRIM25耗尽后形成的菌落较少（图  2g，h）。通过蛋白质印迹分析验证了两种不同siRNA之一对TRIM25的抑制效率（图2i）。其次探索了TRIM25在OTUD5-敲低诱导的细胞增殖增加中的作用。使用慢病毒感染表达shRNA，我们生成了稳定的OTUD5敲低细胞，将针对TRIM25的对照siRNA或siRNA转染到了其中。对于Huh7和Hep3B细胞，TRIM25敲低部分消除了OTUD5耗竭诱导的细胞增殖增加，这表明OTUD5敲低的细胞增殖促进作用可能是由TRIM25介导的（图2j，k）。通过蛋白质印迹证实了这些细胞中RNA干扰对OTUD5和TRIM25的足够消耗（图2l）。

图2 OTUD5敲低以TRIM25依赖性方式促进细胞生长

已显示TRIM25通过其RING域显示的E3泛素连接酶活性发挥其功能。实际上，用抗泛素的抗体检测到与泛素化的TRIM25相对应的涂片，这一发现与E3泛素连接酶的自体泛素化相一致（图 3a）。为了测试OTUD5是否拮抗TRIM25的泛素化作用，生成了几种构建体，这些构建体产生了野生型OTUD5蛋白，催化失活的OTUD5突变蛋白（OTUD5 / C224S）和缺少位点特异性磷酸化的OTUD5蛋白突变体（OTUD5 / S177A）。在体外去泛素化试验中，OTUD5催化了TRIM25的有效去泛素化，而TRIM25的去泛素化则需要OTUD5 DUB活性，此外，磷酸化的OTUD5在去除TRIM25的泛素链方面比野生型OTUD5更有效（图3b，c）。磷酸化缺陷突变体OTUD5（OTUD5 / S177A）的去泛素化活性受到很大损害，表明磷酸化对于OTUD5活性至关重要（图3b，c）。

此外，siRNA介导的OTUD5耗竭增加了TRIM25多聚泛素化（图3d）。随后，当通过野生型OTUD5的转染重构OTUD5水平时，泛素化的TRIM25的水平降低。相比之下，催化突变型OTUD5 / C224S或磷酸化缺陷型突变型UDUD5 / S177A的过表达不能降低OTUD5-nockdown细胞中泛素化的TRIM25的水平（图 3e）。最后，用表达Flag-TRIM25的质粒和三种OTUD5表达构建体之一转染293T细胞，然后用M2磁珠免疫沉淀细胞内容物。在没有OTUD5的情况下，可以通过M2珠纯化泛素化的TRIM25。相反，在用野生型OTUD5转染的细胞中，TRIM25的泛素化显着降低（图3f）。TRIM25的去泛素化依赖于OTUD5的去泛素酶活性及其通过磷酸化的激活，如共表达OTUD5 / C224S或OTUD5 / S177A的细胞没有有效降低泛素化的TRIM25的水平所表明的（图3f）。另外，OTUD5的共过量表达抑制了TRIM25泛素化，表型化了TRIM25 K117R突变体，该突变体缺少重要的TRIM25自体泛素化位点，这表明OTUD5在TRIM25自体泛素化中起着关键作用。有趣的是，TRIM25的稳定性不受内源性OTUD5消耗的影响，这表明OTUD5使TRIM25去泛素化以调节TRIM25功能，而与TRIM25稳定性无关（图3g）。为了确定哪种类型的TRIM25泛素链受OTUD5影响，从细菌中纯化了lys48-UIM融合蛋白和lys63-UIM融合蛋白，用于免疫沉淀测定。IPed蛋白的蛋白质印迹结果表明，OTUD5敲低增加了TRIM25的lys63泛素化。此外进行了具有催化活性突变体OTUD5的菌落形成试验。过表达的OTUD5 / WT抑制集落形成，并且OTUD5 / C224S的过表达不抑制细胞增殖（图3h）。

图3 OTUD5去泛素化TRIM25

假设TRIM25至少部分通过充当转录因子来调节细胞增殖。通过RNA测序探索由TRIM25促进肿瘤发展的机制。通过聚类分析差异基因的表达，该聚类主要集中于关键的细胞信号级联反应，例如细胞周期，细胞凋亡的调控和细胞增殖的调控（图1B）。如图4c所示，PML肿瘤抑制剂是显示最大变异性的差异表达基因之一。TML25基因敲低的细胞中PML表达的升高被PML mRNA和蛋白水平的增加所证实（图 4d，e）。发现，与TRIM25共同过表达上调了PML的泛素化水平，这与先前的报道一致，表明TRIM25通过转录和转录后机制发挥作用。

PML充当通过调节肿瘤抑制如p53，pRb的，CBP和的eIF4E的转录功能的肿瘤抑制。为了进一步确定TRIM25敲低细胞中PML表达改变的影响，通过RT-PCR评估了PML靶基因的表达。在缺乏TRIM25的细胞中，CDK1A，BBC3，BAX和HLA-A的相对表达水平上调，而Bcl2的表达水平仅适度降低（图4h）。此外，TRIM25敲低不再能够上调PML缺失细胞中BAX的阻抑作用（图4i）。如图4k所示，单独使用TSA处理可适度诱导Huh7和Hep3B细胞的细胞死亡。值得注意的是，对TSA处理的响应，PML的抑制抑制了TRIM25缺失的细胞的细胞死亡（图 4k），这表明TML25介导的功能可能需要PML。

然后，通过人类肝细胞癌（HCC）TCGA数据集评估了TRIM25的表达。HCC肿瘤组织中的TRIM25水平高于正常肝组织中的TRIM25水平（图4l）。此外，TRIM25的高表达与肝癌患者的不良预后相关（图4m）。为了评估OTUD5和TRIM25的重叠功能，对OTUD5耗尽的细胞进行了RNA测序分析。对重叠基因进行了基因本体论（GO）分析。丰富的生物学过程主要受细胞周期和细胞分裂过程的影响，这意味着OTUD5-TRIM25轴可能通过调节细胞周期来影响细胞增殖。

图4 TRIM25通过靶向的TSS抑制PML的表达PML

为了探索与TRIM25介导的PML表达调控有关的机制，对Huh7和Hep3B细胞进行了染色质免疫沉淀（ChIP）qPCR分析（图5a）。结果显示，TRIM25主要结合PML基因的转录起始位点（TSS）区域（图5b），这与TRIM25通过定位到PML25充当转录抑制子的观点相一致。通过消耗TRIM25，IRF-8向PML启动子的募集增加（图5c）。这些数据表明TRIM25至少部分地通过抑制IRF-8募集至PML启动子来抑制PML表达的可能性。

图5 TRIM25的转录活性受到RING域的调节

总之，这项研究中，研究人员发现OTUD5在调节细胞增殖和抑制肿瘤中的功能，如异种移植小鼠中 RNAi介导的OTUD5敲低后细胞增殖增加以及OTUD5敲低后肿瘤生长增加所证明的模型。具体而言，OTUD5的这些独特功能是由TRIM25介导的，并且是通过E3泛素连接酶TRIM25与它的去泛素酶OTUD5之间的相互作用来调节PML表达的。随后，显示TRIM25阻断PML表达以促进细胞增殖，并可能促进肿瘤发生，这表明OTUD5通过调节TRIM25 / PML轴发挥功能。删除RING域和TRIM25的K117R突变体具有实质性的抑制功能，这意味着OTUD5通过调节TRIM25的泛素化发挥功能。此外，OTUD5表达降低与侵袭性肿瘤表型和预后不良相关，而OTUD5表达升高与不同癌症患者的生存期延长相关。

本项研究的意义：

（1）揭示了OTUD5在肿瘤发生中的关键作用，正如其与TRIM25的相互作用所表明的那样，表明OTUD5-TRIM25轴在肿瘤进展中起着重要的转录调节剂的作用；

（2）揭示了TRIM25介导的转录抑制的调控机制，可以靶向用于肿瘤治疗。

图6 全文机制图

参考文献

[1]de Vivo, A. et al. The OTUD5-UBR5 complex regulates FACT-mediated transcription at damaged chromatin. Nucleic Acids Res. 47, 729–746 (2019).

[2]Park, S. Y. et al. Deubiquitinase OTUD5 mediates the sequential activation of PDCD5 and p53 in response to genotoxic stress. Cancer Lett. 357, 419–427 (2015).

[3]Hatakeyama, S. TRIM Family Proteins: Roles in Autophagy, Immunity, and Carcinogenesis. Trends Biochem. Sci. 42, 297–311 (2017).